伊藤彰彦教授の論文解説に関しての質疑

「藍葉エキスは新型コロナ（SARS-CoV-2）スパイクとACE2※（アンジオテン シン変換酵素）の結合を抑制する（Indigo plant leaf extract inhibits the binding of SARS-CoV-2 spike protein to angiotensin-converting enzyme 2）」です。

※ACE2はいわゆるレセプターと言われるもので、肺細胞内に多数存在し、ACE2が新型コ ロナウイルスのスパイクと結合することで、新型コロナウイルスが人の細胞内に取り込まれ 増殖する。

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）は、細胞進入の第一 段階でヒト細胞上のACE2（アンジオテンシン変換酵素2）と結合するために、 ウイルス表面のスパイクタンパク質を使用する。トリプタンスリンはd-リモネ ン（17.3μg/ml）を使用して藍葉から抽出され、他のタイプのコロナウイルスであ るHCoV-NL63のACE2を媒介した細胞進入を抑制すると考えられている。こ の研究では、藍葉抽出物※（以後「あおもり藍エキス」と呼ぶ。）が新型コロナ （SARS-CoV-2）スパイクタンパク質のACE2への結合を抑制できるかどうかを 調べた。結合度合は生きた細胞を培養し、結合を蛍光強度として定量化した。 ACE2が過剰発現する犬腎臓MDCK細胞を、蛍光標識化（フルオレセイン標識） されたS1スパイクタンパク質と共に培養した。あおもり藍エキスは、S1タンパ ク質とともに細胞生存率に影響を与えない8,650倍と17,300倍の希釈で細胞に添加したが、蛍光強度は、S1スパイクタンパク質とあおもり藍エキス量に依存して減少した。次にあおもり藍エキスの代わりに4.0-nMトリプタンスリンを添加した。蛍光強度は減少したが、あおもり藍エキス添加の蛍光強度減少度合より低かった。（あおもり藍エキスの方がトリプタンスリンよりスパイクタンパク質―ACE2結合を阻害する）

コンピューターによるドッキングシミュレーション分析では、トリプタンスリ ンはS1タンパク質の受容体結合領域に容易に結合し、2-アミノ酸配列と7-アミ ノ酸配列領域が好ましい結合部位であることが明らかになった。あおもり藍エ キスはS1スパイクタンパク質とACE2の結合を高希釈条件下においても抑制す ると観察され、明らかにトリプタンスリンのみでなく他の抑制要素も含まれてい ると推測できた。このあおもり藍エキスは、新型コロナウイルス（SARS-CoV-2） 感染予防または治療に役立つ可能性がある。

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）は2019年のコロナウ イルス病（COVID-19）の原因であり、スパイクタンパク質（1,2）でヒトアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）に結合してヒト細胞に感染する。SARS-CoV-2スパイクタンパク質はS1受容体結合サブユニットとS2融合サブユニットからなり（2）、 スパイクはこのタンパク質（2）の三量体としてウイルス表面に存在する。スパイクS1サブユニットはACE2への結合を可能にし、その結合部分はレセプターバインディングドメイン（RBD）と呼ばれる（3）。したがって、RBDに対する親和性が高い化合物がスパイクタンパク質と干渉することができれば、ACE2へ の結合を阻害し、SARS-CoV-2感染の予防に有望な候補になると期待されている。

藍葉は、⽇本で⻑い間、服に染めるのに使われてきた。藍葉は⻘⾊染料の 優れた供給源であるだけでなく、抗ウイルス、抗炎症、抗アレルギー活性（4-6） を持っていることが立証されている。同時に、これらの研究と並行して、藍葉の 中の生物活性化合物の識別に著しい進展があった。有効成分の一つはトリプタントリン、インドロ[2，1-b]キナゾリン-6，12-ジオンである。興味深いことに、 ツァイ【Tsai】等はトリプタンスリンがヒトコロナウイルスNL63（HCoVNL63）に対する抗ウイルス作用を持っていると報告した。彼らはHCoV-NL63 でシミアンLLC-MK2とヒトCalu-3細胞を培養し、トリプタンスリンの存在下でウイルスが感染した細胞の数が80%以上減少することを発見し、トリプタントスンがウイルスを殺したり、ウイルスの細胞への侵入を妨害する可能性があることを示唆した。 重要なことは、ACE2上でSARS-CoV-2とHCoV-NL63の結合領域が異なるとしても、HCoV-NL63はACE2に結合するということだ。我々はあおもり藍エキスがACE2に対するSARS-CoV-2結合を抑制できると仮定した。

藍葉から活性成分を抽出するために、芳香剤として広く使用されている非環式モノテルペンである溶媒d-リモネン（+）-p-Mentha-1,8-ジエンを用いた独自の抽出方法を発明した。生成された藍抽出物（あおもり藍エキス）は結果的にトリプタンスリンをかなり高い濃度で含む事が判明している。

本研究では、カプチンスキー【Kapczynski】らの寄託された未定稿 （doi: https://doi.org/10.1101/2021.08.18.456916）を参考に、ACE2を過剰発現する犬腎上皮MDCK細胞を作製し、フルオレセイン標識（蛍光標識）されたS1スパイクタンパク質を用いて、結合程度を蛍光量で定量化できる細胞培養システムを構築した。つまり、ACE2結合は蛍光強度で測定している。同時に、トリプタンスリンとスパイクタンパク質の結合に関し、コンピュータシミュレーション分析を行った。

細胞および試薬について

Madin–Darbyイヌ腎臓（MDCK）細胞を、アメリカン・タイプ・カルチャー・ コレクションから購入、（NBL-2。Manassas、VA、アメカ合衆国）これは10%胎児仔牛血清とイーグルの培地で培養したものである。ヒト結腸腺癌Caco-2細胞を予め理研バイオソースセンター筑波（RCB0988）（9）から購入した。トリプタンスリン（SML0310;シグマリッチバーリントン,MA、アメリカ合衆国）は、ジメチルスルホキシド（DMSO）に1mg/mLの濃度で溶かし、10倍エタノールで希釈 （原液の最終濃度100µg/mL）した。

プラスミドへの遺伝子移入について

全てのRNAは、Caco-2細胞からTrizol試薬（インビトロゲン、ウォルサム City,MAアメリカ合衆国）を用い、第1鎖cDNA上でRNAをテンプレートとして逆転写して抽出した。人ACE2の完全なcDNA（NM_001371415.1）は、Caco-2cDNAをテンプレートとして、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）:順方向 5gtggatgtgatcttggctca-3’と逆転、5caaaatcacctcaagaggaaaaa-3’によって得た。 PCRによって作成されたものを、pTA2TA-クローニングベクター（はじめ、大阪、⽇本）に挿入し、拡大後、pCX4purベクターのNotIとHinc領域に挿入した。突然変異の不在はシークエンス法によって確認し。

MDCK細胞は、6cmの容器で60-70%に培養され、メーカーの手順に従ってLipofectamine3000（インビトロゲン、カールズバッド、CA、アメリカ合衆国） を用いて、pCX4pur-hACE2または空のpCX4purベクター（それぞれ5µg）で遺伝子導入した。

細胞は、ピューロマイシンへの耐性を持つものが選ばれた。

植物材料について

藍葉は2020年9⽉に⻘森県で収穫。証拠標本は東北医科薬科大学薬草園の 植物標本箱に保管され、東北医科薬科大学佐々木教授によって確認された。

藍葉抽出物及び高性能液体クロマトグラフィー（HPLC）準備について

私たちは⽇本で抽出特許を取得している「あおもり藍エキス」という独自の エキスを使用（⽇本特許第6389492号）。これは、粉末状の乾燥葉（100g）を 1,200mLのd-リモネン（和光純化工業）で抽出し、室温で48時間ろ過した後、 淡⻩⾊の抽出物を採取し、HPLCを使用した。構成物を分析するために、あおもり藍エキスをエタノール（5.0mg/mL）に溶解し、⽇本京都市ナカライテスク（4.6×250mm）カラム（移動相40%CH3CN;流量1.0mLmin;検出温度254nm;温度25℃）上を通過させ、SICChromatocorder12（システム機器株式会社）でデータを収集した。トリプタンスリン標準品はシグマ·アルドリッチ·ジャパン（東京） から購入した。その他の試薬はすべて富士フイルム和光純化工業株式会社（東京）から購入した。本研究では、あおもり藍エキスをエタノール（原液）中で10倍希釈し、同時にd-リモネンをエタノール中で10倍希釈した。参考までに、藍の葉をエタノール（99.5%）で同じ手順で抽出した。

S1タンパク質とフルオレセイン（蛍光）標識について

マウスIgG2aFc（S1N-C5257）と正常マウスIgG（mIgG;140-09511）で標識 された組換えタンパク質SARS-CoV-2S1サブユニットは、ACROBiosystems（Newark、DE、USA）と富士フイルム和光純化化学から購入した。フルオレセイン標識キット-NH2（熊本県道真堂）を使用して、S1タンパク質とマウスIgGにフルオレセインを結合させた。

MDCK細胞培養におけるフルオレセイン蛍光の検出と定量化について

10µL培養液中に3×10³個のMDCK細胞を懸濁させ、µ皿（35mm、高さ、 80406番;ibidi）上のマイクロインサート容器底部に分離させ移植した。3時間培養した後、150µLの培地を注入し、すべてに同一培地を注入した。翌⽇、3µg/mLの濃度でフルオレセイン標識S1またはmIgGを培地に添加した。同時に藍葉抽出物、d-リモネンまたはトリプタンスリンを指定した濃度で添加した。24時間培養した後、マイクロインサートガスケットを緩やかに除去し、培養液で細胞を3回洗浄した。 その後、µ-皿は1mLの培地で満たされ、C2+共焦点レーザースキャンシステムの顕微鏡ステージに置かれた。フルオレセイン蛍光像は40倍対物レンズで撮影され、ニコンC2+コンピューターシステムで分析された。フルオレセイン（蛍光）強度（単位面積当たり任意の単位）は、分析制御ツールを使用して、各皿に対してランダムに選択された5つの高出力フィールドで測定された。 µ-皿上に細胞培養物を作成し、実験群ごとに三回測定し、ROI統計を用いてフルオレセイン強度の平均と標準偏差を計算した。実験は独立して3回繰り返され、 同様な結果が出た。

免疫蛍光法について

S1タンパク質から蛍光を検出した後、-20℃、10分間メタノールでµ-皿の細胞を固定し、室温で2%牛血清アルブミンで30分間ブロックした。この時、どの皿でも蛍光は検出されなかった。その後、4℃でACE2（E-11、sc390851;SantaCruz、CA）に対する抗体で培養し、アレクサ⼩⻨粉488結合二次抗体（抗マウスIgG;JacksonImmonResearch、PA、WestGrove）で視覚化した。 リン酸塩緩衝食塩水（PBS）で3回洗浄した後、核は4℃で2時間DAPI（分子プローブ、カールスバッド、CA）で標識された。蛍光画像は488nmアルゴンと543nmヘリウムネオンレーザー（Nikon）を備えたC2+共焦点スキャンシステムを使用して捕捉した。

水溶性テトラゾリウム-8測定法について

細胞生存率は細胞計数キット8（⽇本熊本県道真堂）を用いて水溶性テトラゾリウム-8（WST-8）ベースの比⾊測定法で評価した。MDCK細胞（3×10⁴）は一晩プレートに植え付け後、表示された希釈速度でそれぞれの場所にあおもり藍エキスを添加した。翌⽇、WST-8で細胞を30分間培養し、自動マイクロプレートリーダーを使用して450nmで吸光度を測定した。WST-8のミトコンドリアデヒドロゲナーゼ開裂をホルマザン染料で染⾊出来たことは細胞生存性を示唆した。

ウェスタン·ブロット分析について

細胞はPBSで洗浄され、50mMTris-HCl（pH8.0）、150mMNaCl、1%トリトンX-100、1mMフェニルメチルスルホニルフッ化物を含む緩衝剤で溶解した。 遠心分離により不純物を除去した後、溶質をウエスタンブロット分析した。免疫反応性帯域強度は、前述の通りImageJソフトウェア（米国国立衛生研究所、ベセスダ、MD、アメリカ合衆国）を使用して定量化した。

分子シミュレーションについて

我々はタンパク質データバンク（https://www.rcsb.org/）（PDBID:6Z97）から SARS-CoV-2スパイクタンパク質三量体の3D構造を得た。この構造を選択したのは、次の条件を満たすためだ。

（1）受容体アクセス可能な”上向き”構造が三量体で利用可能であること。
（2）アミノ酸配列が欠失なく保存され、かつ、
（3）構造は3.5Å未満の解像度で利用可能であること。

トリプタンスリンの3D構造はPubChemデータベース （https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）からダウンロードされた（CID:73549;他のコンフォーマーは知られていない）。このような構造を使用して、我々は受容体結合モチーフ（RBM）を囲むグリッドボックスでAutoDock4.2を使用してトリプタントリンとスパイクタンパク質に対するドッキングラン100回をシミュレー トした。その後、バインディングモードでACE2バインディングサイトへのドッキング数を分析した。

統計分析について

2つ以上のグループで構成された実験について比較分析を行った。分散の一方向分析（分散分析）を使用して蛍光強度を比較した。各グループの平均を計算し、一方向分散分析のボンフェローニ補正を使用して二つのグループ間の平均値を比較した。 WST-8データはダネットの多重比較テストで分析された。2つのグループの比較は学生のt-testで行われた。P-値が0.05以下であることは統計的に有意であると考えられる。 スピアマンランク試験を用いた細胞密度とCADM1タンパク質レベルの相関は、R2≧0.1とP≦0.05であれば有意であると考えられる。

あおもり藍エキスのHPLCについて

保持時間26.328分のHPLCピークをトリプタンスリンとし、その濃度は17.3μg/mLと推定した。 この濃度はエタノールを用いた抽出物よりもはるかに高かった。 13~20分、35~40分、45~50分の間に他の高いピークがあった。これらのピークは既知の化合物として認識できなかった。

MDCK細胞でACE2に結合したS1タンパク質の検出について

ヒトACE2全⻑cDNAと空ベクトルを伝送するpCX4purベクトルにMDCK細胞を移植し、 ACE2（MDCK-ACE2）とベクトル制御細胞（MDCK-ベクター） をそれぞれ強力に発現する細胞を得た。ACE2の発現は免疫蛍光分析と⻄洋式ブロット分析によって確認された。抗ACE2抗体は、MDCK-ACE2細胞の細胞膜にACE2発現を明確に検出し、MDCK-ACE2細胞からの溶出物ではなく、 MDCK-ベクターや未転移MDCK細胞からの溶出物から~150kDaバンドとして検出した。

我々は生きた細胞培養においてACE2に対するS1タンパク質の結合を定量的に検出しようとした。 この目的のためにマウスIgGFcと融合したS1タンパク質を使用し、フルオレセイン（蛍光）で標識した。得られたタンパク質（S1-Fc-フルオレセイン）は、未転送のMDCK、MDCK-ベクター、およびMDCK-ACE2 細胞培養にμ-皿濃度3μg/mLで添加された。24時間後、生きている細胞をPBSで洗浄し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した。MDCK-ACE2細胞の細胞膜には蛍光がはっきりと検出されたが、未転移MDCKやMDCK-ベクター細胞には見られなかった。陰性対照のため、マウスIgGはフルオレセインで標識され、培養物に追加された。いずれの細胞でも蛍光は検出されなかった。細胞の種類と治療環境ごとに蛍光強度を計算した。S1-Fc-フルオレセインを培養したMDCKACE2細胞は、他の培養物に比べて蛍光強度がはるかに高かった。

あおもり藍エキスによるS1-ACE2結合の阻害について

WST-8分析によると、8,650倍以上希釈した場合、あおもり藍エキスはMDCK細胞生存性に実質的な影響を及ぼさないことが明らかになった。あおもり藍エキスはこの希釈範囲（4.39~7.44）で培地pHを変化させなかった。S1-Fcフルオレセインと共に、MDCK-ACE2細胞培養液をμ-皿で1730倍（原抽出物の17300倍）の希釈で混合し、24時間後に細胞が生きていることを観察した。 蛍光信号は弱い検出でも可能であった。蛍光強度は、あおもり藍エキスを含まないMDCK-ACE2細胞培養に比べてあおもり藍エキスを含む方がはるかに低かった。

あおもり藍エキスは17.3μg/mLの濃度でトリプタンスリンを含んでいるため、上記処理においてトリプタンスリン濃度は1.0ng/mLと推定される。あおもり藍エキスの代わりに、MDCK-ACE2細胞培養物にS1-Fc-フルオレセインとともにトリプタンスリン（分子量248.24）のみを濃度1.0ngmLまたは4.0nMで添 加した。フルオレセインの蛍光強度は低下したが、あおもり藍エキスによる蛍光強度の低下よりも低下の度合いは低かった。（あおもり藍エキスがトリプタンスリンよりもS1スパイク・ACE 結合の阻害度合いが高い）

次に、我々はさらに5倍希釈された86,500倍希釈されたあおもり藍エキスを使用した。S1-ACE2結合に対する抑制効果は実質的に消失し、あおもり藍エキスの効果は用量依存であることが示唆された。その後、培養物に添加されたあおもり藍エキスとS1-Fc-フルオレセインの濃度比を変更した。この比率とS1 蛍光強度には有意な相関関係があった。すなわち、あおもり藍エキスの相対濃度が高いほどS1蛍光強度が低下し、S1-Fc-フルオレセインの割合が高いほどS1蛍光強度が増加する。

17,300倍希釈であおもり藍エキス及びd-リモネン、1.0ngmLでトリプタンスリンで処理したMDCK-ACE2細胞に対してウエスタンブロット分析と免疫蛍光を行った。両実験ともACE2の発現は基本的にどちらの治療法でも変わらないことが明らかになった。

S1–ACE2バインディングのドッキングシミュレーションについて

分子シミュレーション方法は、MDCK細胞上のACE2に対するS1タンパク質の結合をトリプタンスリンが抑制するメカニズムを検討するために使用された。 PDBを検索し、PDBID6M0Jを用いてACE2に結合されたスパイクタンパク質三量体の3D構造を描き、スパイクタンパク質三量体PDBID6Z97の3D構造を得た。トリプタントリンがRBMにどのように結合するかを調べるためにドッキングシミュレーション分析を行った。我々は100回のドッキングランの半分以上で6M0J（13）で報告されたACE2結合部位に優先的に結合されたトリプタントリン分子を発見した。特に、これらの結合のほとんどは、Leu455–Phe456とCys488–Ser494の周りのRBM表面にほぼ垂直な結合モードを示した。この2つ の領域において、S1スパイクタンパク質はACE2とトリプタントリンとの結合に関与する4つのアミノ酸を有することをシミュレートした。

本研究では、哺乳類細胞上のACE2に結合されたSARS-CoV-2スパイクタンパク質の量を容易に定量化できる細胞培養測定システムを構築した。このシステムは様々な試薬による結合抑制効果を評価するのに有用であることが分かった。 また、d-リモネンを溶媒として抽出したあおもり藍エキス（分子量136.23、比重0.842gml）によってこの結合が抑制されることを発見した。d-リモネンは哺乳類細胞の生存可能性と成⻑をその濃度によって抑制するといわれるが、過去の研究によると、d-リモネンは0.6μLmL（1,667倍v希釈）と0.5mM（14,15）においてもPC12細胞生存率とDU-145とPZ-HPV-7細胞生存率に影響を及ぼさない。我々 は主に17,300倍の希釈のあおもり藍エキスを使用した。WST-8アッセイは、この濃度はMDCK細胞が健康を維持するのに十分低いことを示した。したがって、この濃度におけるあおもり藍エキスは有為である。実際、我々はあおもり藍エキスまたはd-リモネンで処理されたMDCK細胞においてACE2発現の実質的な変 化を検出しなかった。これはまた、あおもり藍エキスがACE2発現ではなく、S1-ACE2結合を高い希釈率で抑制するという概念を支持している。

本研究は、トリプタンスリンがS1-ACE2結合を抑制することを示したが、あおもり藍エキスの全体抑制効果を説明することはできなかった。トリプタンスリンはカルー3細胞とLCC-MK2細胞でそれぞれIC50値0.30μMと1.52μMのHCoV-NL63感染性を低下させることが報告されている。我々は4.0nMの濃度でトリプタンスリンを使用し、トリプタンスリンがSARS-CoV-2に対して効果的であることを示唆した。しかし、この推測は単純すぎるかもしれない。なぜなら、我々はACE2を過度に発現させるMDCK細胞の感染性ではなく、S1- ACE2結合に対する抑制効果だけを調査したからだ。私たちが知る限り、トリプタンスリンの最⼩50%細胞毒性濃度（CC50）はCalu-3細胞（7）に対して173.2μMであり、トリプタンスリンは一般的にヒト正常細胞（16,17）に対して有意な細胞毒性がないと考えられている。 細胞毒性の観点からトリプタンスリンは安全な濃度範囲内でS1-ACE2結合抑制剤として作用することが期待できる。

トリプタンスリンはS1タンパク質よりはるかに⼩さいので、どうやって結合を抑制できるのか疑問に思うかもしれない。ドッキングシミュレーションによると、トリプタントリンは主に9つのアミノ酸残基を使用してスパイクタンパク質三量体のRBMに結合し、そのうち4つはS1RBM-ACE2結合に関与し、分子 面はRBM表面にほぼ垂直である。この結合構造は、トリプタンスリンがなぜS1タンパク質とACE2の結合を抑制するのかを説明することができる。トリプタンスリンは⼩さいが、RBM-ACE2結合に必須な部位と結合することができる。 このシミュレーションと一貫して、培養物に添加されたあおもり藍エキスとS1タンパク質の濃度比を変更した細胞培養実験により、あおもり藍エキスの競争性が立証された。しかし、もう一つの可能性が残っている。トリプタンスリンはS1タンパク質よりACE2に強い親和性を持っているかもしれない。ACE2は心臓機能制御に重要であるため、臨床応用を考慮する際、この可能性を慎重に検討しなければならない。

また、本研究はあおもり藍エキスがトリプタントリンの他に他の有効成分を含んでいることを示唆している。d-リモネンはエタノールと比較して配糖体のような高極性成分ではなくトリプタンスリンを含む低極性成分を抽出する事が分かっている。この機能を念頭に置いて、あおもり藍エキスに含まれる有効成分を分離して識別する予定だ。藍は一般的に食品に分類され、毒性は報告されていないため、マウスに鼻腔内であおもり藍エキスを投与する生体内実験も開発中である。抽出物と他の有効成分に対する薬物動態分析が計画されている。

結論的に、我々はあおもり藍エキスが細胞生存性に影響を及ぼさないほど低い濃度でS1スパイクタンパク質とACE2の結合に抑制効果があることを証明した。 有効成分の一つはトリプタンスリンのようだが、あおもり藍エキスには他の有効成分が含まれている可能性が高い。さらなる調査により、SARS-CoV-2感染の予防策として、この天然製品を実用化するための新たな道が開かれる可能性がある。